Identifikasi Mikroba Metode Pewarnaan Gram
Identifikasi mikroba merupakan salah
satu tugas yang lazim dilakukan di laboratorium mikrobiologi. Bakteri memiliki beberapa macam
bentuk yaitu basil (tongkat), coccus, dan spirilum. Bakteri yang berbentuk
tongkat maupun kokus dibagi menjadi beberapa macam. Pada bentuk basil
pembagiannya yaitu basil tunggal, diplobasil, dan tripobasil.Sedangkan pada
coccus dibagi menjadi monococcus, diplococcus, sampai stophylococcus. Khusus
pada spirilum hanya dibagi dua yaitu setengah melengkung dan melengkung.
Identifikasi mikroba dilakukan untuk bisa mengenali dan membedakan berbagai
jenis mikroba itu sendiri. Jenis-jenis identifikasi mikroba
terbagi atas dua yaitu secara langsung dan secara uji biokimiawi (pewarnaan). Pada metode langsung, mikroba diperiksa
dalam keadaan hidup. Sediaan basah dilakukan dari bahan pemeriksaan langsung,
menggunakan KOH untuk jamur dan NaCl untuk melihat bakteri dalam keadaan
hidup. Pada metode pewarnaan, terlebih dahulu dilakukan pewarnaan kemudian
diamati secara mikroskopik karena bakteri hidup pada umumnya tidak berwarna dan
tembus cahaya sehingga jika diperiksa secara langsung tidak dapat terlihat
jelas. Uji biokimiawi bakteri adalah salah satu uji yang dilakukan untuk
mengidentifikasi jenis bakteri. Hal ini karena setiap jenis bakteri memiliki
sifat biokimia yang berbeda. Metode ini dilakukan dengan cara pewarnaan.
Pewarnaan mikroba terbagi atas pewarnaan sederhana dan pewarnaan diferensial.
Bakteri yang hidup
hampir tidak berwarna dan kontras dengan air, dimana sel-sel bakteri tersebut
disuspensikan. Salah satu cara untuk mengamati bentuk sel bakteri sehingga
mudah untuk diidentifikasi ialah dengan metode pengecatan atau pewarnaan. Hal
tersebut juga berfungsi untuk mengetahui sifat fisiologisnya yaitu mengetahui
reaksi dinding sel bakteri melalui serangkaian pengecatan. Teknik pewarnaan warna
pada bakteri dapat dibedakan menjadi dua macam yaitu pewarnaan sederhana, dan pewarnaan
diferensial. Pewarnaan sederhana merupakan cara untuk melihat morfologi bakteri
secara umum dengan menggunakan satu macam zat pewarna sedangkan pewarnaan
diferensial merupakan metode untuk mengenali berbagai jenis bakteri menggunakan
lebih dari satu zat pewarna. Pewarnaan diferensial terbagi atas pewarnaan tahan
asam dan pewarnaan Gram.
Pewarnaan Gram merupakan salah satu
teknik pewarnaan diferensial yang menggunakan lebih dari dua macam zat pewarna.
Pewaranaan Gram adalah suatu metode
untuk membedakan jenis bakteri menjadi dua kelompok besar berdasarkan komponen
penyusun dinding selnya, yaitu Gram-positif dan Gram-negatif. Prinsip pewarnaan gram adalah kemampuan
dinding sel terhadap zat warna dasar setelah pencucian dengan alkohol 70%. Bakteri Gram positif akan menyerap
Kristal violet pada pewarnaan gram sehingga sel bakteri pada jenis ini akan
berwarna ungu saat diamati dengan mikroskop, sedangkan bakteri Gram negative
tidak dapat mempertahankan pewarna primer Kristal violet saat dekolorisasi
dengan alkohol. Bakteri gram negative dapat menyerap zat pewarna sekunder
sehingga akan berwarna merah pada saat diamati dengan mikroskop. Zat warna yang digunakan pada
perwarnaan gram meliputi kristal violet , iodin , alkohol dan safranin.
Bakteri
Gram positif merupakan bakteri yang dinding selnya mengandung peptidoglikan dan
juga asam teikoat dan asam teikuronat. Oleh sebab itu dinding sel bakteri Gram
positif ini tebal dan sebagian adalah polisakarida. Pada beberapa bakteri asam
teikoat merupakan antigen permukaan (antigen dinding sel), dan ada yang
merupakan selaput pada selnya. Pada pewarnaan Gram bakteri Gram positif
berwarna ungu karena dapat mempertahankan zat pewarna primer Kristal violet.Bakteri
Gram negatif merupakan bakteri yang dindinng selnya dapat menyerap warna merah.
Bakteri ini memiliki lapisan peptidogligan yang tipis yang terdapat pada ruang
periplasmik yaitu antara membrane luar dan membrane plasma. Bakteri jenis ini
memiliki peptidoglikan yang tipis dan mengandung banyak lipid sehingga pewarna
primer mudah larut saat dekolorisasi. Berikut ini merupakan perbedaan antara bakteri Gram Positif dan Gram Negatif.
Identifikasi mikroba
metode pewarnaan gram menggunakan beberapa zat atau reagen yaitu Kristal
Violet, Lugol, Alkohol, Safranin dan Aquades. Kristal Violet berfungsi sebagai
pewarna primer yang hanya dapat diserap oleh bakteri gram positif. Larutan lugol berfungsi untuk memfiksasi
pewarna primer sehingga dapat mengintensifkan pengikatan warna oleh mikroba
serta untuk memperkuat pengikatan warna oleh mikroba. Safranin berfungsi
sebagai pewarna sekunder yang dapat diserap oleh bakteri gram negatif yang sebelumnya
melepaskan pewarna primer saat dekolorisasi. Alkohol berfungsi untuk
melunturkan pewarna primer dan yang terakhir Aquades berfungsi untuk membilas
semua jenis reagen yang diteteskan pada preparat sehingga lebih mudah untuk
diamati.
·
Kristal violet merupakan pewarna primer
(utama) yang berfungsi untuk
memberi warna ungu pada sel bakteri positif karena dinding sel bakteri ini
dapat mengikat larutan Kristal violet. Larutan Kristal violet memiliki
komposisi Kristal violet, Alkohol 95%, Aquadest, dan Amonium
oksalat . Kristal violet merupakan pewarna primer (utama) yang akan
memberi warna sel bakteri. Pemberian
kristal violet pada bakteri Gram positif akan meninggalkan warna ungu muda.
Perbedaan respon terhadap mekanisme pewarnaan Gram pada bakteri adalah
didasarkan pada struktur dan komposisi dinding sel bakteri. Pada gram positif
yang memiliki Peptidoglikan yang tebal, pewarna Kristal violet lebih mudah
berikatan dengan sel dan sulit dilepaskan. Sebaliknya, gram negatif memiliki
peptidoglikan yang tipis sehingga tidak mudah berikatan dengan pewarna Kristal
violet yang menyebabkan bakteri jenis ini akan melepaskan pewarna Kristal
violet saat dekolorisasi.
·
Safranin digunakan sebagai
pewarna sekunder dalam beberapa pewarnaan preparat proses Identifikasi mikroba
metode pewarnaan. Komposisi dalam safranin adalah O Safranin, Alkohol 95%, dan
Aquadest. Zat
pewarna ini berfungsi untuk mewarnai kembali sel-sel yang telah kehilangan
pewarna utama setelah dekolorisasi menggunakan alkohol. Safranin juga berperan
sebagai pewarna tandingan yang menggantikan zat pewarna primer pada bakteri
gram negative yang telah luntur akibat dekolorisasi. Pewarna safranin masuk ke
dalam sel dan menyebabkan sel menjadi berwarna merah pada gram negative.
Sedangkan pada gram positif, dinding selnya yang telah terdehidrasi saat
dekolorisasi dengan alkohol, daya rembes dinding sel dan membran menurun
sehingga pewarna safranin tidak dapat masuk dan diserap.
·
Alkohol
merupakan denaturan protein, suatu sifat yang terutama memberikan aktivitas antimikrobial pada alkohol. Alkohol mengandung
etanol dan diencerkan hingga konsentrasi 70% menggunakan akuades. Alkohol dalam
proses pewarnaan gram digunakan untuk untuk melunturkan atau memucatkan warna
primer. Pada gram positif, dinding sel yang tebal memicu terjadinya dehidrasi
pada sel bakteri yang menyebabkan pori-pori dinding sel menutup dan mencegah
larutnya kompleks Kristal iodium. Pada bakteri gram positif yang mengandung banyak lemak pada
lapisan dinding selnya mengakibatkan pori-pori dinding sel membesar dan mempercepat
proses pemucatan warna pada pewarna primer.
·
Larutan lugol adalah pewarna mordan yang
berfungi untuk memperkuat pewarna primer. Iodium Lugol adalah suatu larutan yang
terdiri dari unsur iodium (I2) dan kalium iodide (KI) yang
dilarutkan bersama dengan aquades. Pada pewarnaan gram, Lugol digunakan selama
1 menit setelah mewarnai dengan kristal violet, tetapi sebelum etanol untuk
memastikan bahwa peptidoglikan organisme
gram positif tetap diwarnai, sehingga mudah mengidentifikasinya sebagai gram
positif dalam mikroskop.
·
Aquades
digunakan dalam metode pewarnaan gram untuk melunturkan warna utama
yaitu Kristal violet sehingga dapat memperjelas pengamatan. Aquades dilakukan
beberapa kali saat praktikum yang dimana setelah pemberian warna utama akan
dibilas dengan dengan aquades kemudian diberikan dengan warna penguat
selanjutnya dibilas kembali dengan aquadest hal ini bertujuan untuk memperjelas
pengamatan. Dibilas kembali dengan aquadest hal ini bertujuan untuk
membersihkan sisa iodium pada bakteri. dan ketika penambahan alkohol pada sel
bakteri dilakukan kembali pembilasan dengan aquades agar membersihkan sisa
alkohol pada bakteri dan saat penambahan warna sekunder dilakukan kembali
pembilasan dengan aquades yang digunakan untuk membersihkan sisa safranin
sehingga memperjelas pengamatan.
Sebelum dan setelah reagen
diteteskan pada kaca preparat, dilakukan fiksasi. Fiksasi adalah proses pelekatan dan
penempelan struktur sel mikroorganisme pada suatu posisi. Fiksasi dilakukan
setelah pengolesan mikroba pada kaca preparat. Olesan yang belum kering akan
mengakibatkan sel-sel mikroba menjadi tidak beraturan bentuknya. Fiksasi yang
terlalu lama akan menimbulkan kematian sel pada bakteri sehingga selnya sulit
dilihat di mikroskop. Tujuan dari fiksasi adalah agar mikroba dapat melekat
dengan baik dan tidak mudah larut saat proses pembilasan dengan akuades.
Jumlah bakteri yang terdapat pada preparat haruslah cukup banyak sehingga dapat
terlihat bentuk dan penataanya sewaktu diamati. Kesalahan yang sering kali
dibuat adalah menggunakan suspensi bakteri yang terlalu padat, sehingga pada
saat diatami sel-sel bakteri tidak terlihat dengan jelas.
DAFTAR PUSTAKA
Cahyanti,
Antonia nani. 2011. Viabilitas Probiotik Lactobacillus
casei Pada Yogurt Susu Kambing Selama
Penyimpanan Beku. Jurnal Teknologi
Pertanian Vol. 12 No. 3 hal 176-180. Semarang.
Ernawati.
2012. Isolasi Dan Identifikasi Bakteri Asam Laktat Pada Susu Kambing Segar. Jurnal Sains. Malang:Universitas Islam
Negeri
Nydia,
D Venny. 2016. Perbedaan Bakteri Gram
Positif dan Gram Negarif. Semarang:Universitas Muhammadiyah. Semarang.
Pelczar,
MJ. 2007. Dasar-Dasar Mikrobiologi.
Jakarta: Universitas Indonesia Press.
Purwohadisantoso. 2008. Isolasi Bakteri Asam Laktat. [Skripsi] Malang;Universitas
Brawijaya.
Rakhmawati,
Anna. 2012. Penyiapan Media
Mikroorganisme. Yogyakarta:Universitas Negeri Yogakarta.
terbait meman ilmuanya... semoga bermanfaat
BalasHapus