Identifikasi Mikroba Metode Pewarnaan Gram

Identifikasi mikroba merupakan salah satu tugas yang lazim dilakukan di laboratorium mikrobiologi. Bakteri memiliki beberapa macam bentuk yaitu basil (tongkat), coccus, dan spirilum. Bakteri yang berbentuk tongkat maupun kokus dibagi menjadi beberapa macam. Pada bentuk basil pembagiannya yaitu basil tunggal, diplobasil, dan tripobasil.Sedangkan pada coccus dibagi menjadi monococcus, diplococcus, sampai stophylococcus. Khusus pada spirilum hanya dibagi dua yaitu setengah melengkung dan melengkung. Identifikasi mikroba dilakukan untuk bisa mengenali dan membedakan berbagai jenis mikroba itu sendiri. Jenis-jenis identifikasi mikroba terbagi atas dua yaitu secara langsung dan secara uji biokimiawi (pewarnaan). Pada metode langsung, mikroba diperiksa dalam keadaan hidup. Sediaan basah dilakukan dari bahan pemeriksaan langsung, menggunakan KOH untuk jamur dan NaCl untuk melihat bakteri dalam keadaan hidup. Pada metode pewarnaan, terlebih dahulu dilakukan pewarnaan kemudian diamati secara mikroskopik karena bakteri hidup pada umumnya tidak berwarna dan tembus cahaya sehingga jika diperiksa secara langsung tidak dapat terlihat jelas. Uji biokimiawi bakteri adalah salah satu uji yang dilakukan untuk mengidentifikasi jenis bakteri. Hal ini karena setiap jenis bakteri memiliki sifat biokimia yang berbeda. Metode ini dilakukan dengan cara pewarnaan. Pewarnaan mikroba terbagi atas pewarnaan sederhana dan pewarnaan diferensial.

Bakteri yang hidup hampir tidak berwarna dan kontras dengan air, dimana sel-sel bakteri tersebut disuspensikan. Salah satu cara untuk mengamati bentuk sel bakteri sehingga mudah untuk diidentifikasi ialah dengan metode pengecatan atau pewarnaan. Hal tersebut juga berfungsi untuk mengetahui sifat fisiologisnya yaitu mengetahui reaksi dinding sel bakteri melalui serangkaian pengecatan. Teknik pewarnaan warna pada bakteri dapat dibedakan menjadi dua macam yaitu pewarnaan sederhana, dan pewarnaan diferensial. Pewarnaan sederhana merupakan cara untuk melihat morfologi bakteri secara umum dengan menggunakan satu macam zat pewarna sedangkan pewarnaan diferensial merupakan metode untuk mengenali berbagai jenis bakteri menggunakan lebih dari satu zat pewarna. Pewarnaan diferensial terbagi atas pewarnaan tahan asam dan pewarnaan Gram.

Pewarnaan Gram merupakan salah satu teknik pewarnaan diferensial yang menggunakan lebih dari dua macam zat pewarna. Pewaranaan Gram adalah suatu metode untuk membedakan jenis bakteri menjadi dua kelompok besar berdasarkan komponen penyusun dinding selnya, yaitu Gram-positif dan Gram-negatif. Prinsip pewarnaan gram adalah kemampuan dinding sel terhadap zat warna dasar setelah pencucian dengan alkohol 70%. Bakteri Gram positif akan menyerap Kristal violet pada pewarnaan gram sehingga sel bakteri pada jenis ini akan berwarna ungu saat diamati dengan mikroskop, sedangkan bakteri Gram negative tidak dapat mempertahankan pewarna primer Kristal violet saat dekolorisasi dengan alkohol. Bakteri gram negative dapat menyerap zat pewarna sekunder sehingga akan berwarna merah pada saat diamati dengan mikroskop. Zat warna yang digunakan pada perwarnaan gram meliputi kristal violet , iodin , alkohol dan safranin.

Bakteri Gram positif merupakan bakteri yang dinding selnya mengandung peptidoglikan dan juga asam teikoat dan asam teikuronat. Oleh sebab itu dinding sel bakteri Gram positif ini tebal dan sebagian adalah polisakarida. Pada beberapa bakteri asam teikoat merupakan antigen permukaan (antigen dinding sel), dan ada yang merupakan selaput pada selnya. Pada pewarnaan Gram bakteri Gram positif berwarna ungu karena dapat mempertahankan zat pewarna primer Kristal violet.Bakteri Gram negatif merupakan bakteri yang dindinng selnya dapat menyerap warna merah. Bakteri ini memiliki lapisan peptidogligan yang tipis yang terdapat pada ruang periplasmik yaitu antara membrane luar dan membrane plasma. Bakteri jenis ini memiliki peptidoglikan yang tipis dan mengandung banyak lipid sehingga pewarna primer mudah larut saat dekolorisasi. Berikut ini merupakan perbedaan antara bakteri Gram Positif dan Gram Negatif.

Identifikasi mikroba metode pewarnaan gram menggunakan beberapa zat atau reagen yaitu Kristal Violet, Lugol, Alkohol, Safranin dan Aquades. Kristal Violet berfungsi sebagai pewarna primer yang hanya dapat diserap oleh bakteri gram positif. Larutan lugol berfungsi untuk memfiksasi pewarna primer sehingga dapat mengintensifkan pengikatan warna oleh mikroba serta untuk memperkuat pengikatan warna oleh mikroba. Safranin berfungsi sebagai pewarna sekunder yang dapat diserap oleh bakteri gram negatif yang sebelumnya melepaskan pewarna primer saat dekolorisasi. Alkohol berfungsi untuk melunturkan pewarna primer dan yang terakhir Aquades berfungsi untuk membilas semua jenis reagen yang diteteskan pada preparat sehingga lebih mudah untuk diamati.

·         Kristal violet merupakan pewarna primer (utama) yang berfungsi untuk memberi warna ungu pada sel bakteri positif karena dinding sel bakteri ini dapat mengikat larutan Kristal violet. Larutan Kristal violet memiliki komposisi Kristal violet, Alkohol 95%,  Aquadest, dan Amonium oksalat . Kristal violet merupakan pewarna primer (utama) yang akan memberi warna sel bakteri. Pemberian kristal violet pada bakteri Gram positif akan meninggalkan warna ungu muda. Perbedaan respon terhadap mekanisme pewarnaan Gram pada bakteri adalah didasarkan pada struktur dan komposisi dinding sel bakteri. Pada gram positif yang memiliki Peptidoglikan yang tebal, pewarna Kristal violet lebih mudah berikatan dengan sel dan sulit dilepaskan. Sebaliknya, gram negatif memiliki peptidoglikan yang tipis sehingga tidak mudah berikatan dengan pewarna Kristal violet yang menyebabkan bakteri jenis ini akan melepaskan pewarna Kristal violet saat dekolorisasi.

·         Safranin digunakan sebagai pewarna sekunder dalam beberapa pewarnaan preparat proses Identifikasi mikroba metode pewarnaan. Komposisi dalam safranin adalah O Safranin, Alkohol 95%, dan Aquadest. Zat pewarna ini berfungsi untuk mewarnai kembali sel-sel yang telah kehilangan pewarna utama setelah dekolorisasi menggunakan alkohol. Safranin juga berperan sebagai pewarna tandingan yang menggantikan zat pewarna primer pada bakteri gram negative yang telah luntur akibat dekolorisasi. Pewarna safranin masuk ke dalam sel dan menyebabkan sel menjadi berwarna merah pada gram negative. Sedangkan pada gram positif, dinding selnya yang telah terdehidrasi saat dekolorisasi dengan alkohol, daya rembes dinding sel dan membran menurun sehingga pewarna safranin tidak dapat masuk dan diserap.

·         Alkohol merupakan denaturan protein, suatu sifat yang terutama memberikan aktivitas  antimikrobial pada alkohol. Alkohol mengandung etanol dan diencerkan hingga konsentrasi 70% menggunakan akuades. Alkohol dalam proses pewarnaan gram digunakan untuk untuk melunturkan atau memucatkan warna primer. Pada gram positif, dinding sel yang tebal memicu terjadinya dehidrasi pada sel bakteri yang menyebabkan pori-pori dinding sel menutup dan mencegah larutnya kompleks Kristal iodium. Pada bakteri  gram positif yang mengandung banyak lemak pada lapisan dinding selnya mengakibatkan pori-pori dinding sel membesar dan mempercepat proses pemucatan warna pada pewarna primer.

·         Larutan lugol adalah pewarna mordan yang berfungi untuk memperkuat pewarna primer. Iodium Lugol adalah suatu larutan yang terdiri dari unsur iodium (I₂) dan kalium iodide (KI) yang dilarutkan bersama dengan aquades. Pada pewarnaan gram, Lugol digunakan selama 1 menit setelah mewarnai dengan kristal violet, tetapi sebelum etanol untuk memastikan bahwa peptidoglikan  organisme gram positif tetap diwarnai, sehingga mudah mengidentifikasinya sebagai gram positif dalam mikroskop.

·         Aquades  digunakan dalam metode pewarnaan gram untuk melunturkan warna utama yaitu Kristal violet sehingga dapat memperjelas pengamatan. Aquades dilakukan beberapa kali saat praktikum yang dimana setelah pemberian warna utama akan dibilas dengan dengan aquades kemudian diberikan dengan warna penguat selanjutnya dibilas kembali dengan aquadest hal ini bertujuan untuk memperjelas pengamatan. Dibilas kembali dengan aquadest hal ini bertujuan untuk membersihkan sisa iodium pada bakteri. dan ketika penambahan alkohol pada sel bakteri dilakukan kembali pembilasan dengan aquades agar membersihkan sisa alkohol pada bakteri dan saat penambahan warna sekunder dilakukan kembali pembilasan dengan aquades yang digunakan untuk membersihkan sisa safranin sehingga memperjelas pengamatan.

Sebelum dan setelah reagen diteteskan pada kaca preparat, dilakukan fiksasi. Fiksasi adalah proses pelekatan dan penempelan struktur sel mikroorganisme pada suatu posisi. Fiksasi dilakukan setelah pengolesan mikroba pada kaca preparat. Olesan yang belum kering akan mengakibatkan sel-sel mikroba menjadi tidak beraturan bentuknya. Fiksasi yang terlalu lama akan menimbulkan kematian sel pada bakteri sehingga selnya sulit dilihat di mikroskop. Tujuan dari fiksasi adalah agar mikroba dapat melekat dengan baik dan tidak mudah larut saat proses pembilasan dengan akuades. Jumlah bakteri yang terdapat pada preparat haruslah cukup banyak sehingga dapat terlihat bentuk dan penataanya sewaktu diamati. Kesalahan yang sering kali dibuat adalah menggunakan suspensi bakteri yang terlalu padat, sehingga pada saat diatami sel-sel bakteri tidak terlihat dengan jelas.

DAFTAR PUSTAKA

Cahyanti, Antonia nani. 2011. Viabilitas Probiotik Lactobacillus casei Pada Yogurt Susu Kambing Selama Penyimpanan Beku. Jurnal Teknologi Pertanian Vol. 12 No. 3 hal 176-180. Semarang.

Ernawati. 2012. Isolasi Dan Identifikasi Bakteri Asam Laktat Pada Susu Kambing Segar. Jurnal Sains. Malang:Universitas Islam Negeri

Nydia, D Venny. 2016. Perbedaan Bakteri Gram Positif dan Gram Negarif. Semarang:Universitas Muhammadiyah. Semarang.

Pelczar, MJ. 2007. Dasar-Dasar Mikrobiologi. Jakarta: Universitas Indonesia Press.

Purwohadisantoso. 2008. Isolasi Bakteri Asam Laktat. [Skripsi] Malang;Universitas Brawijaya.

Rakhmawati, Anna. 2012. Penyiapan Media Mikroorganisme. Yogyakarta:Universitas Negeri Yogakarta.